焦点1：说明书中记载的相关实验数据能否证明本专利的技术效果？

　　请求人：本专利说明书中采用PI值，即（变体残留比活）/（亲本酶残留比活）来表征热稳定性的改善，PI值>1则表示热稳定性能的改善。然而，说明书中记载的作为分母的亲本酶残留比活为15%-44%，其中最大值为最小值的约3倍，表明活性值离散度很大，本领域技术人员无法确认PI值>1的结果是否是由于亲本酶离散度过大这一实验误差所带来的，而说明书中也未记载原始数据和数据统计分析方法说明上述问题。另外，本专利在测定亲本酶残留比活时，所使用的酶样品是包括杂质蛋白的上清液而非纯化的亲本酶，这意味着测定过程中所测定的蛋白质涵盖了杂质蛋白，由此测定得到的比活数值及进一步计算得到的PI值也是不准确的，因此不足以证明本专利取得了改善比活和/或热稳定性的技术效果。

　　专利权人：在酶活性的测量中，检测试剂等原因都可能导致亲本酶活性的绝对值发生变化，但这个属于日常变动，反证4的内容表明酶活性存在日常变动是一个客观事实。本专利通过对同一批次的比较对象同时测量平衡和抵消了计算过程中无关变量对测定结果的影响。由于PI值是一个比值，因此，尽管上清液中含有其他的杂质蛋白，在将二者的比活数值相除之后，其对测定结果带来的影响已被抵消。而且本专利的亲本酶和变体酶是通过重组表达获得的，因此目的蛋白的含量相对于杂质蛋白是占据绝大多数的，故杂质蛋白对酶活性测定的影响并不大。

　　焦点2：本领域技术人员为了得到性能改变的来源于里氏木霉的葡糖淀粉酶变体，是否有动机基于证据1公开的黑曲霉葡糖淀粉酶相关变体来选择权利要求1中限定的具体的突变位点？

　　请求人：本领域技术人员知晓，大部分葡糖淀粉酶均具有相同的构架，而且证据4已经指出黑曲霉和里氏木霉同属曲霉家族，二者的葡糖淀粉酶都属葡糖淀粉酶家族，结构同源，基于二者相同的功能，以及二者结构上的同源性或同一性比对，在证据1明确提及对黑曲霉葡糖淀粉酶第44位的氨基酸残基进行突变会影响酶的比活和/或热稳定性的基础上，本领域技术人员容易想到对里氏木霉葡糖淀粉酶中存在的与该位点相对应的第43位氨基酸残基进行突变，以改善亲本酶的比活和/或热稳定性。

　　专利权人：黑曲霉葡糖淀粉酶和里氏木霉葡糖淀粉酶全长序列的比对显示二者同一性仅有44%，即同一性很低，反证6也显示黑曲霉和里氏木霉在分类学上属于不同的纲，因此，无法基于黑曲霉葡糖淀粉酶的结构功能信息直接预期里氏木霉葡糖淀粉酶上结构功能信息。此外，证据1基于一种计算机分子模拟的方法，预测出多达271个可突变位点，但对于是否在第44位进行突变没有任何说明和指示，因此，如果不基于本专利中所公开的第43位位点，本领域技术人员并没有动机会在证据1中所公开的数百个位点中选择出第44位位点，请求人认为的本领域技术人员容易想到在里氏木霉葡糖淀粉酶中与上述位点对应的第43位位点进行突变是后见之明。况且，证据1中采用了多种不同的预测方法，但每种预测方法所获得的结果却不一样，因此本领域技术人员基于证据1也无法准确判断哪个位点的突变会带来性能的改善。

　　焦点3：证据2公开的葡糖淀粉酶GA107是否给出了将里氏木霉第43位的氨基酸残基突变为权利要求限定的具体氨基酸的技术启示？

　　请求人：证据2公开的葡糖淀粉酶GA107的比活明显高于野生型里氏木霉葡糖淀粉酶，二者在第43位氨基酸残基处存在差异，且上述氨基酸残基位于催化腔内，与酶催化过程中发生重要作用的相关残基邻近，本领域技术人员容易想到该位点对酶的活性具有重要影响，并对该位点进行突变。

　　专利权人：GA107和野生型里氏木霉葡糖淀粉酶的差异氨基酸数量多达61个，本领域技术人员无法判断GA107比活的提高是由于哪个或哪些位点的氨基酸差异所致，从61个差异位点中选择第43位位点进行突变的可能性很小，选择该位点只能是看到本专利后的后见之明。况且，GA107的第43位为T，而本专利的葡糖淀粉酶的第43位并不涉及使用T残基进行取代。（来源：中国知识产权报　作者：国家知识产权局专利复审委员会　杨莹跃）